発現解析
リードのカウント
生成したbamファイルとアノテーションファイル ( gtfファイル ) をもとに、ある遺伝子領域にマッピングされたリード数を数えます。
このパイプラインではhtseq-countがリード数をカウントするためのツールになります。
出力結果はtxtファイルとして生成します。txtファイルはテキストファイルのため そのままで見ることができます。
txtファイルをlessコマンドで見るとリードがカウントされていることがわかります。 ( テキストファイルを見る方法 )
出力ファイルのフォーマットなどは https://htseq.readthedocs.io/en/master/count.html を見てください。
2群間比較
カウントしたデータをもとに発現量について2群間比較を行います。
2群間比較をすることで発現変動遺伝子を検出します。
このパイプラインではDeseq2を使ったプログラムを実行します。
Deseq2については
を参考にしてください。
ファイル名 |
説明 |
|---|---|
maplot1.png |
MA-plot ( pvalue < 0.05 の遺伝子を取り出し、plotMA関数を用いた場合 ) |
maplot2.png |
MA-plot ( baseMeanが0の遺伝子を除き、plotMA関数のalphaを0.05とした場合 ) |
DispEsts.png |
Dispersion plot ( plotDispEsts関数による出力 ) |
barplot.png |
p値が小さい遺伝子の割合 |
hist.png |
p値のヒストグラム |
sample_dist.png |
主成分分析の寄与率 ( prcomp関数を用いた場合 ) |
heatmap1.png |
サンプル間の距離のヒートマップ |
pca1.png |
PCA plot ( varianceStabilizingTransformation関数で処理した後にplotPCA関数で出力したもの ) |
pca2.png |
PCA plot ( rlog変換後にprcomp関数を用いた場合 ) |
scatter1.png |
Scatter plot ( log変換した場合 ) |
scatter2.png |
Scatter plot ( rlog変換した場合 ) |
gene_clustering.png |
サンプル間の分散の大きい35の遺伝子のサンプルごとのヒートマップ |
all_rld.csv |
カウントデータをrlog関数で処理したもの |
all_ntd.csv |
カウントデータをnormTransform関数で処理したもの |
all_results.csv |
results関数の出力 ( baseMeanが0の遺伝子を除いた場合 ) |
geneset/*.png |
genesetであらかじめ準備した遺伝子のサンプルごとのヒートマップ |
Genomon Expression
カウントしたリード数を特定のエクソンにマッピングされた全てのリードのオーバーラップしている部分の塩基数の総和とそのエクソンの長さとエクソンにマッピングされた全てのリードの塩基数の総和を用いて補正したものを算出します。https://supcom.hgc.jp/internal/materials/lect-pdf/20171030/Genomon2_Tutorial_1.pdf ( hgcのアカウントが必要です。)を参考にしてください。
Note
fastaファイルのprefix
Genomonはfastaファイルのprefixからchrを取り除いていますが、
このパイプラインではchrをつけていても動くように
GenomonExpression-0.4.0を改変しています。